Apa yang mungkin menjadi masalah jika band tidak muncul di Western Blot?

Jawapan:

Banyak …

Penjelasan:

Terdapat banyak sebab mengapa band tidak boleh muncul di blot barat. Adakah kombinasi sampel dan antibodi yang digunakan pada masa lalu?

Berikut adalah beberapa perkara yang boleh saya fikirkan pada masa ini yang mungkin menyebabkan band tidak muncul:

1. Adakah pemindahan protein dari gel? Cuba pewarnaan membran dengan sesuatu seperti ponceau S atau hitam amido untuk melihat sama ada band hadir. Kadang-kadang, anda boleh melihat kumpulan protein pada membran dengan membasahi dan memegangnya pada sudut cahaya.

2. Adakah antibodi utama berfungsi? Ini adalah satu yang sukar untuk diuji dan satu-satunya cara anda boleh dengan memasukkan kawalan positif di mana anda tahu bahawa anda mempunyai protein faedah yang ada sekarang. Sekiranya anda mempunyai beberapa protein yang menarik, anda boleh cuba membentangkannya ke membran Barat yang membongkok (iaitu anda tidak menjalankan gel) dan melihat jika anda mendapat keputusan jika anda memproses membran seolah-olah ia adalah kelumpuhan barat.

3. Adakah antibodi sekunder mengiktiraf antibodi utama? Sekali lagi, yang sukar untuk diuji. Mengenai satu-satunya ujian yang boleh anda lakukan ialah ujian tempat yang dinyatakan di atas dalam 2.

4. Adakah "sistem pengesanan" berfungsi? Bergantung pada kaedah pengesanan yang anda gunakan, anda boleh mencuba spiking di beberapa antibodi sekunder untuk melihat sama ada penyelesaian pengesanan, dan juga agen / enzim yang mencetuskan pada antibodi sekunder, sedang berfungsi. Iaitu, bolehkah anda mencetuskan tindak balas hanya dengan antibodi sekunder?

Akhirnya, ia boleh semudah salah satu daripada penyelesaian yang digunakan semasa meneliti plot yang dibuat dengan salah. Sebagai contoh, jika kepekatan garam itu salah dalam penampan maka ini boleh menyebabkan antibodi dibebaskan dari penipisan. Begitu juga jika pH buffer tidak betul.

Penyebab "pelik" yang menyebabkan kebodohan barat tidak berfungsi yang saya alami secara peribadi adalah apabila kami menukar pembekal serbuk susu yang digunakan untuk menyekat membran. Serbuk dari pembekal baru ini mengandungi fosfatase phosphotyrosine yang menghilangkan semua kumpulan fosfat yang kami cuba mengesan dengan antibodi anti-phosphotyrosine kami.